細胞共培養方法的研究進展
發布時間：2020-04-03 09:32
細胞共培養方法的研究進展
細胞培養的歷史應追溯到 19 世紀 80 年代，德國學者Wilhelm Roux 從雞胚中分離細胞首次建立體外細胞培養；Earle 和 Dulbecco 于 1943 年創建了單層細胞培養。細胞培養技術于 20 世紀 30 年代傳入我國，最早開展在植物胚芽的培養上，因其具有培養簡單、易操作、費用低、可大量應用的優點，被廣泛應用于生物學及組織學的各個領域。然而，單層細胞培養雖然易于操作、培養條件便于調控，但與人體內環境存在差距；而細胞共培養技術能彌補單層細胞培養的缺陷，有利于構建更接近人體狀態的體外生理或病理模型。細胞共培養又稱為復合培養或混合培養，是指將 2 種或2 種以上細胞放在同一培養系統中培養。與單層細胞培養技術相比，細胞共培養技術可以很大程度地模擬體內環境，以便更好地觀察細胞與細胞、細胞與培養環境之間的相互作用，通過檢測不同細胞因子之間的關系，探討藥物的作用機制和可能的作用靶點。細胞共培養技術一直倍受關注，主要用于研究誘導干細胞分化、提高代謝物產量、提高細胞生存能力、維持細胞功能和活性、體外組織的構建等。目前，細胞共培養方法主要包括直接接觸共培養、間接接觸共培養和三維細胞共培養，3 種方法的選擇主要根據共培養細胞的正常形態、研究者的目的以及研究能否方便、順利進行而決定。
1 直接接觸共培養法
直接接觸共培養是指把 2 種或 2 種以上細胞放在同一培養體系中，使之直接接觸。這種方法適用于體內鄰近的組織細胞，主要因為這些細胞在體內可通過通訊連接、封閉連接和錨定連接等方式傳遞所產生的細胞因子，而直接接觸式培養可保留這些連接信息，使培養的細胞更接近體內自然狀態；該方法還適用于 2 種生長狀態相同的細胞，例如 2 種貼壁細胞或 2 種懸浮細胞。這種方法的優點是操作方便，對培養皿或培養瓶的要求較低，一般常用的細胞支持物即可。該方法主要用于研究細胞間相互作用以及誘導細胞分化。劉堯將人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）與人軟骨細胞（hACs）從人體分離培養后，接種于絲素蛋白支架上進行直接共培養，通過蘇木素 - 伊紅（HE）染色技術、Ⅱ型膠原染色技術觀察細胞形態，并與在同樣支持物下用誘導劑培養的 hBMSCs，以及單純 hACs 進行比較，發現 hBMSCs 與 hACs直接接觸共培養有利于軟骨細胞外基質的產生。Watanabe等發現，在與自身骨髓間充質干細胞（BMSCs）的相互接觸共培養中，人髓核細胞生物學活性明顯提高。還有研究表明，將內皮細胞和神經干細胞直接接觸共培養后，在血管內皮生長因子的作用下，內皮細胞可以促進神經干細胞增殖，并有向神經細胞分化的趨勢。
臨床細胞移植治療也可以被看作是外源細胞和自身細胞的直接接觸共培養，其中間充質干細胞因易獲得、易培養、較穩定，具有強大的增殖能力，且不違背倫理道德被廣泛用于科研與臨床。陳肖等將分離的 BMSCs 接種于創傷弧菌膿毒癥模型小鼠，探討其對創傷弧菌膿毒癥肺損傷的作用，發現 BMSC 能降低炎性因子水平并減輕肺損傷。雖然直接接觸共培養操作簡單，但其難度在于對指標的考察，因為很難用一般的方法將 2 種形態相同的細胞區別開來，目前可以使用形態學方法檢測，或者用雙標免疫組化技術或原位雜交技術，或用不同的熒光標記，亦可以用 2 種不同標記的抗體或探針進行免疫組化或雜交，以分清 2 種不同的細胞，并可分析 2 種細胞之間的關系。2 間接接觸共培養法
2.1 條件培養基共培養法：條件培養基是用培養過一種細胞的培養基培養另一種細胞，2 種細胞不直接接觸，而細胞因子可以交流，其優點是可以消除目的細胞對條件細胞的影響，突出條件細胞對目的細胞的作用。此法簡便易行，但是時間上的不統一是不可控因素，因此嚴格來說，這種方法介于單層細胞培養和共培養之間，是單層細胞培養與共培養之間的過渡。宋旆文等［17］利用這種方法觀察 BMSCs 條件培養基對神經干細胞（NSCs）分化的影響，在徹底避免了 2 種細胞接觸產生作用的情況下，觀察到 NSCs 的貼壁分化，肯定了 BMSCs 條件培養基對 NSCs 貼壁分化的積極作用，而不依賴于 BMSCs 本身，為 BMSCs 條件培養基與 NSCs 共同移植提供了依據。周凌等以雞胚絨毛尿囊膜模型（CAM）作為血管生成體內模型，觀察到與單層細胞培養相比，人食管癌細胞株 Eca-9706 細胞條件培養基可顯著增加人臍靜脈內皮細胞的增殖、遷移以及小管形成。
2.2 “爬片式”共培養法：
“爬片式”共培養法是將細胞先接種在處理后的玻片上，待細胞貼壁后，以一定比例放入另一種細胞的培養皿中與其共培養。有研究者用該方法將接種了骨髓單核細胞的玻片或骨片置入提前 24 h 接種了成骨細胞的培養皿中進行共培養，結果顯示，成骨細胞對破骨細胞的調控作用顯著，誘導的破骨細胞具有噬骨能力，成功建立了共培養模型，用于成骨細胞和破骨細胞之間的相互調控作用研究。
2.3 嵌入式細胞共培養法（Transwell 小室）：嵌入式共培養法又稱“筏式”培養法或 Transwell 共培養體系，是指將帶有聚碳酯（PC）、聚酯（PET）或膠原包被的聚四氟乙烯（PTFE）膜的 Transwell小室放在相應的培養板上建立的共培養體系。Transwell 小室底部的膜將上下層細胞分開，膜的直徑小于3.0 μm，一般為 0.4 μm，細胞不能自由通過此膜，但細胞因子可以自由通過，兩者可通過此膜進行信息交流。嵌入式細胞共培養法是目前應用最多的方法。這種間接共培養法可用于各種生長狀態的細胞，其優點是便于分離 2 種細胞，可更好地觀察其各自的細胞狀態變化，以探討一種細胞對另一種細胞的作用。Cao 等［20］采用 Transwell 小室共培養處理過的內皮細胞和上皮細胞，探討了多壁碳納米管棕櫚酸在心血管疾病中的作用。張明通過分離、培養人纖維環（AF）細胞與 BMSCs，分別吸取第 3 代 AF 細胞和 BMSCs，按 1：1 比例分別植于 Transwell 小室共培養系統中，下室植入 BMSCs，上室植入 AF 細胞，以建立 2 種細胞間接共培養模型，從而探討了共培養體系對 AF 細胞增殖和細胞外基質合成的影響，以及 BMSCs 是否具有向 AF 細胞分化的能力。Holownia 等將煙霧處理過的單核細胞株 THP-1 細胞置于 Transwell 小室上層，肺泡上皮細胞株 A549 細胞置于小室下層，共培養24 h，探討香煙煙霧對共培養條件下 A549 和 THP-1 細胞的影響，從而得出在暴露于煙霧條件下，THP-1 細胞對 A549細胞可能有保護作用的結論。
2.4 其他間接接觸共培養方法：
在共培養過程中，研究者也可以用現有的實驗設備制作簡易的共培養裝置。魏會秒利用自制 48 孔培養板，以 6 孔為一個單元，先將大鼠多器官原代細胞單獨培養，采用在相鄰兩孔壁上打孔的方法使 6 孔細胞培養基共享，從而構成間接共培養體系，建立了大鼠多器官原代細胞共培養模型，并以各原代細胞單獨培養作為對照，探討了不同刺激物對不同靶器官的毒性作用。李華等采用 6 孔細胞培養板和 6 孔懸掛式培養皿建立共培養模型，將人臍帶間充質干細胞及人肝細胞株 LO2 細胞共培養，發現在此條件下，人臍帶間充質干細胞可以分化為肝樣細胞。
文獻來源：秦燕勤 陳玉龍 李建生 450046 河南鄭州，河南中醫學院老年醫學研究所（秦燕勤、李建生），分子生物學實驗中心 （陳玉龍） 通訊作者：陳玉龍，Email：cyl72621@163.com DOI：10.3760/cma.j.issn.2095-4352.2016.08.022
下一篇：植物干細胞培養研究進展