植物干細胞培養研究進展

隨著我國制藥工業及功能性食品行業的迅速發展，對植物中活性成分的需求日益增長。植物中的活性成分具有抗衰老、提高免疫力及保護心腦血管等的作用[1]，但其質量受環境因素和收獲條件的影響，活性物質產量低[2-3]，有些植物的活性成分僅限于特定的組織部位或生長階段合成[4-5]。對于結構復雜、人工合成困難的活性成分，傳統的愈傷組織培養方式雖然可以在短時間內生產有價值的產品[6]，節約了資源，但是經歷脫分化的愈傷組織液泡化程度高，常常增加了細胞的異質性，對振蕩培養的剪切力敏感，經多次有絲分裂后，容易產生DNA甲基化[7]以及轉座子被激活[8]等變異現象，導致培養過程不穩定，天然產物的產量、性質不穩定等缺點，難以適應現代工業生產需求[9]。
 
干細胞的概念起源于20世紀60年代的動物胚胎學研究，其含義“具有自我更新復制能力和分化潛能的細胞”。與此相對應，植物干細胞實為傳統植物解剖學范疇中的分生組織，包括莖尖分生組織(Shoot apical meristem)、根尖分生組織(Root apical meristem)、側生分生組織[10]以及部分髓射線細胞，其具有產生所有分化細胞類型的能力[11]以及旺盛的分裂能力和較高的遺傳穩定性。植物干細胞具有多個小液泡、線粒體活性高、聚集度低[12-13]、細胞壁無木質素沉積[14-15]等特點，低溫保藏后仍維持較高的細胞活性，在懸浮培養過程中大部分以單細胞形式存在，對剪切力不敏感，能維持穩定的增殖速度，可以長期穩定培養。2010年，Lee等在Nature Biotechnology上成功報道了紅豆杉形成層干細胞的分離及3 t生物反應器培養研究[16]，隨后越來越多種植物的干細胞研究被報道，本研究在總結上述研究結果的基礎上，對當前植物干細胞的分離、培養、鑒別及應用情況進行綜述，并對植物干細胞培養的前景進行了展望，為該領域的深入研究提供參考。
 
1 植物干細胞培養
植物干細胞處于未分化狀態，其分離方法是建立在傳統的組織培養基礎上，具體步驟包括：1)含分生組織的外植體消毒處理；2)干細胞的誘導；3)分離并收集干細胞；4)干細胞的鑒定。目前關于植物干細胞的誘導和大規模培養等研究報道較少，植物干細胞培養僅見于形成層干細胞、莖尖干細胞及根尖干細胞培養。
 
1.1 植物貯藏根形成層干細胞的分離及培養
目前關于貯藏根形成層的培養，僅見于胡蘿卜、人參及當歸。具體包括：外植體的消毒、抗褐化培養、滲透處理以及誘導培養獲得形成層干細胞系。在實際培養過程中滲透處理對形成層干細胞系的獲得尤為重要，所選用的滲透劑以及滲透劑的濃度至關重要，實際操作過程中0.6 mol/L蔗糖效果最佳，使對滲透壓敏感的非形成層組織壞死，而對滲透壓不敏感的干細胞保持活性。處理后的外植體置于誘導培養基上，一段時間后，所得細胞系即為干細胞系[17]。滲透劑一般為蔗糖溶液，也有用KCl、甘露醇等作為滲透劑的報道[18-19]。干細胞誘導之初對植物激素的要求相對嚴格，有報道表明誘導初期用IBA或IAA，而其他激素無效果，繼代培養基中一般添加2, 4-D即可?；谏鲜龇椒?，人參、胡蘿卜以及當歸細胞系均已成功培養[17, 20]，并且建立了當歸和人參細胞的氣升式反應器，人參形成層細胞與愈傷組織相比，倍增時間為3−6 d，而愈傷組織的倍增時間為28 d，生長速度提高了5−9倍，人參皂苷的含量(Re、Rb1、Rb2和Rd)尤其是在野山參中達到了3%。該細胞系提取物可以抗腫瘤、提高免疫力，并且還具有抗氧化、抑制皺紋產生的效果[17]。當歸干細胞懸浮培養21 d后，鮮重增長為2.83倍，愈傷組織為1.67倍，同時當歸干細胞合成次級代謝產物活性較強，干細胞阿魏酸含量為9.118 mg/kg，而在愈傷組織中未檢測到阿魏酸[20]。
 
筆者在實驗過程中發現進行人參形成層干細胞的分離時有的材料自帶內生菌，會對實驗過程造成干擾，需要在實際的分離過程中選擇合適的消毒方法以及培養條件，一般選擇在干細胞誘導培養基中加入抗生素處理；另外，可能由于品種不同，形成層干細胞誘導的條件不同，實驗過程中需要針對特定的品種摸索具體的實驗條件，才能保證成功獲得干細胞系。
 
1.2 木本及草本植物形成層干細胞的培養
采集的枝條置于抗壞血酸溶液中防止氧化，外植體常規消毒后，盡量去除韌皮部等非形成層組織，將含有形成層的組織切分后置于含有IAA或NAA的誘導培養基上，一段時間后形成層細胞自然分層，收集細胞繼代培養。研究者們利用上述方法成功獲得了銀杏及紅豆杉干細胞系[21-22]，所獲得的干細胞系建立了大規模的懸浮培養體系，銀杏干細胞最終建立了250 L的氣升式反應器，且干細胞干重達到了11.7 g/L，其提取物可以清除自由基，具有強烈的抗氧化作用，在制藥、功能性食品領域具有較強的工業實用性。在紅豆杉干細胞懸浮培養方面，氣升式反應器中干細胞增長明顯優于愈傷組織，3 L生物反應器中培養4個月后，來自針葉和胚胎的愈傷組織(Callus)干重分別為3.33 g和5.08 g，而干細胞(Stem cell)干重為3 819.44 g。并且3 L反應器中，加入誘導子50 mg/L殼聚糖和100 μmol/L茉莉酮酸甲酯，以及0.1 mmol/L的前體苯丙氨酸處理后的愈傷組織紫杉醇含量分別達到了11 mg/kg和13 mg/kg，而干細胞中紫杉醇含量達到了98 mg/kg，明顯高于愈傷組織中紫杉醇含量，經過研究人員對培養參數的篩選和優化，建立了3 t紅豆杉干細胞生物反應器，實現了大規模工業生產[16]。
 
除此之外草本植物干細胞也有相關報道，韓國建國大學Moon等基于上述方法建立了長春花干細胞系[23]，結果表明，含有1.5 mg/L NAA和0.5 mg/L KT的B5培養基中長春堿含量達到最大值(0.794 mg/g)，含有1.5 mg/L NAA和1.5 mg/L KT的B5培養基中長春新堿的含量達到最大值(0.279 mg/g)。不僅如此，韓國云火公司的Lee和Jin等已經成功獲得了番茄和菊花以及艾蒿干細胞，并建立了氣升式生物反應器，3 L反應器中，番茄干細胞的生長速率達到了6.3倍，而愈傷組織的生長速率只有1.9倍，在250 L的氣升式反應器中干細胞的干重達到了12.6 g/L，番茄干細胞的提取物可以促進原膠原的形成，抑制膠原分解酶的形成，起到了抑制皺紋的作用[24]。菊花干細胞在3 L反應器中培養14 d后，細胞由最初的4.1 g/L增長到了11.8 g/L，干細胞系提取物不僅具有抑制由脂多糖處理引起的NO產生的效果，而且還具有抑制環氧化酶-2 (Cyclooxygenase-2，COX-2)表達的效果，因此該細胞系可用于生產消炎藥及功能性飲料[25]。
 
1.3 莖尖干細胞培養
關于莖尖干細胞的分離培養僅見于擬南芥莖尖干細胞和蘆薈莖尖干細胞。不同于其他草本植物，蘆薈干細胞挑選幼嫩的莖尖作為外植體。常規消毒后，切取莖尖，置于含有NAA和6-BA的誘導培養基中培養。獲得的細胞團用0.25%的纖維素酶和0.25%的果膠酶進行酶解，所得到的細胞即為干細胞[26]，該細胞系凍干粉中蘆薈苷含量達到了150.80 mg/g，顯著增加了蘆薈苷的含量。
 
干細胞系的獲得，除了常規誘導方面，也有通過轉入抗性篩選基因進行干細胞系建立的報道，廈門大學沈宏通過該方法建立了擬南芥莖尖干細胞系[27]。
 
1.4 根尖干細胞培養
根尖干細胞的誘導：首先將去除根冠的根組織切分成1 mm大小，置于含有2, 4-D的誘導培養基上，暗培養一段時間后，靜止中心細胞繼代于含有2, 4-D的培養基上擴增，利用該方法獲得了水稻干細胞[28]。在此基礎上暨南大學的王一飛等建立了鐵皮石斛的干細胞系，并建立了10 L的懸浮培養體系，利用超低溫冷凍、超聲波破碎以及真空干燥等方法制備了鐵皮石斛干細胞凍干粉，鐵皮石斛干細胞提取物具有較高的POD (Peroxidase)、SOD (Superoxide dismutase)以及CAT (Catalase)酶活性，具有較強的抗氧化作用，干細胞凍干粉對成纖維細胞的光老化具有抑制作用，提高了其SOD酶活性，其制備的眼霜還具去除眼袋和淡化黑眼圈的效果[29]。
 
2 植物干細胞的鑒別
植物干細胞具有多個小液泡、線粒體活性高[12-13]以及細胞壁不含木質素[14-15, 23]等特點，在干細胞鑒別方面，主要依據其自身特點對一些特定的細胞器進行染色觀察，以此區別于愈傷組織等非干細胞系。目前常用的染色方法有如下幾種：1)中性紅液泡系染色；2)間苯三酚木質素染色；3) Janus green B線粒體染色。除此之外，與愈傷組織相比，在干細胞中存在特異表達或高表達的基因。
 
2.1 中性紅染色
中性紅是液泡特殊的活體染色劑，由于液泡呈酸性，進入液泡的中性紅解離出大量陽離子而呈現櫻桃紅色，所以通過液泡染色可以區別干細胞系。
 
韓國云火公司Lee等誘導培養紅豆杉形成層細胞后，對干細胞進行了中性紅染色，結果表明，形成層細胞內具有多個被染色的紅色小液泡，而愈傷組織細胞內呈現出一個中央大液泡[16]，在人參以及菊花干細胞中也觀察到具有多個小液泡的現象。實際操作中發現在干細胞組織學染色過程中，中性紅染色使用PBS (Phosphate-buffered saline)比Ringer溶液(Ringer’s solution)染色效果好。
 
2.2 間苯三酚染色
間苯三酚反應是確定木質化細胞壁最常用的方法，間苯三酚在酸性環境下與細胞壁中的木質素發生櫻桃紅色或紫紅色反應。
 
Moon等將誘導出來的長春花形成層細胞與愈傷組織細胞進行間苯三酚染色，結果表明，形成層細胞無鹽酸-間苯三酚染色反應，而愈傷組織細胞發生紫紅色染色反應。這一結果表明，愈傷組織細胞的細胞壁有木質素沉積，形成層細胞無木質素沉積為初生壁[23]。筆者在實際操作過程中發現間苯三酚染色過程中，鹽酸的濃度對染色效果影響很大，研究發現低濃度鹽酸顯色效果欠佳，0.5 mol/L以上鹽酸濃度顯色效果較好。
 
2.3 線粒體染色
Janus green B對線粒體專一性染色，由于線粒體中的細胞色素氧化酶的作用，使Janus green B始終保持氧化狀態呈藍綠色，而在周圍的細胞質中染料被還原成無色。干細胞具有較高的線粒體活性，所以經Janus green B染色可以區別干細胞系。研究者利用Janus green B對銀杏和番茄形成層細胞線粒體進行染色，銀杏細胞線粒體染色結果顯示出愈傷組織線粒體較少，而形成層細胞短棒狀線粒體較多，可以為細胞的增殖和分化提供能量[21, 24]。筆者在試驗過程中發現，針對線粒體的染色常規的操作是將材料完全浸沒在染液當中，而對于干細胞系來說，這樣的處理結果并不理想，進行少量多次滴加染液效果更好。
 
3 植物干細胞中特異表達基因的研究
在植物干細胞中，存在一些特異表達或高表達的基因。ATHB-8 (ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX 8)被認為是原形成層細胞的分子標記，在形成層細胞特異表達，可以保護原形成層前體細胞不受極性生長素流(AUXIN flow)的干擾而保持形成層細胞的穩定性[30-31]。WOX4 (WUSCHEL HOMEOBOX RELATED 4)基因主要在形成層中表達，形成層中存在TDIF (Tracheary element differentiation inhibitory factor)多肽，具有抑制形成層細胞分化并且促進細胞增殖的功能，與受體激酶PXY (Phloem intercalated with xylem)胞外結構域特異結合形成TDIF-PXY通路促進WOX4的表達[32]，并且在形成層分生組織中還存在PIN1 (PIN-FORMED1)以及HAM4 (HAIRY MERISTEM4)等上調表達基因[32-34]。最近研究表明，維管形成層分生組織中AVB (ABNORMAL VASCULAR BUNDLES)基因參與維持側生原基發育中的正常細胞分裂模式，是形成層細胞所必需的[35]。
 
CLV3 (CLAVATA3)作為莖尖干細胞分子標志基因，在分生組織細胞表達，可促進分生組織細胞增殖，WUS蛋白通過胞間連絲運輸到干細胞區域[36]，直接與CLV3啟動子結合，抑制CLV3的表達，從而抑制干細胞的增殖，二者構成CLV-WUS負反饋調節通路[37]，以維持干細胞的數量穩定。最新研究發現CIKs (CLAVATA 3 INSENSITIVE RECEPTOR KINASES)受體激酶作為受體通過磷酸化傳遞CLV3的信號，抑制WUS的表達，從而維持莖尖分生組織的平衡[38]。
 
WOX5 (WUS RELATED-HOMEOBOX 5)特異性地在根尖靜止中心細胞中表達，抑制干細胞的分化，在根尖中CLE40 (CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION40)蛋白在干細胞和中柱細胞中表達，通過ACR4(ARABIDOPSIS CRINKLY 4)受體傳導CLE40的信號，抑制WOX5的表達，促進干細胞的分化，以維持根尖干細胞的穩定[39-41]。在根尖干細胞中還存在QC25 (Quiescent center)以及QC46[42-43]等特異表達的基因，近年研究表明在根尖干細胞中存在RGF (Root meristem growth factor)小肽[44]，RGF的受體RGFRs (RGF receptors)和RGI (RGF1 INSENSITIVES)能夠響應RGF信號，促進PLT (PLETHORA)轉錄因子的表達，PLT可促進分生組織細胞的分裂，以維持根尖分生組織穩定[45-47]。
 
早在2003年研究者開始對根尖干細胞的表達譜進行了分析，結果表明在根尖干細胞區域存在差異表達基因[48]，韓國的Lee等通過基因表達譜比較了紅豆杉形成層細胞和愈傷組織細胞的差異，確定了563個基因在形成層細胞中表達不同，其中296個基因呈現正調控[16]。Yadav等對莖尖干細胞的表達譜也進行了分析，結果表明莖尖干細胞中，在CLV3表達區域還存在AIL5、AIL6 (AINTEGUMENTA-LIKE)等特異表達的基因，但這些基因的功能有待進一步研究[49-50]。
 
4 植物干細胞應用及展望
植物干細胞培養克服了傳統組織培養中培養物對剪切力敏感、次生代謝產物低、遺傳不穩定等問題。與愈傷組織相比，植物干細胞在長期培養條件下可以維持穩定的增殖速度，在食品、藥品及化妝品行業具有更廣闊的應用前景。研究表明經干細胞培養后提取的有效成分在治療艾滋病、抑制黑色素瘤、治療肝炎、抗氧化和抗衰老、抑制異常的細胞凋亡、殺傷癌細胞等方面都具有很好的療效[22-23, 51-56]。
 
韓國在植物干細胞誘導及培養方面積累了豐富的經驗，已報道了人參及野山參、長春花、紅豆杉、銀杏、菊花等藥用植物形成層干細胞的誘導、培養、鑒定、大規模發酵培養、培養物活性成分分析等[16-17, 21, 23, 25]。我國的科學家們在該領域的研究也取得了豐碩的成果：嚴春燕等分離并培養了當歸干細胞[20]；廈門大學沈宏等分離培養了擬南芥莖尖干細胞[27]；暨南大學王一飛等用鐵皮石斛干細胞凍干粉生產的眼霜具有明顯的抗衰老效果[29]；曾憲卓等通過分離并培養蘆薈莖間干細胞，測得蘆薈干細胞凍干粉中蘆薈苷的含量顯著提高，達到了150.80 mg/g，為醫療、化妝品和功能性食品行業提供了良好的基礎[26]；功能性食品方面，陳海佳等制備的蘋果干細胞凍干粉可以作為胃腸道保健食品[57]；林淑芳等利用番茄干細胞凍干粉制備了口服液、飲料和白酒，研究結果表明，其制備的產品具有抗氧化、預防癌癥、降血壓、降低膽固醇以及調節免疫力的效果[58]。
 
植物細胞不受動物病原體的污染，生產成本較低，并且植物干細胞培養具有諸多優勢，利用基因工程手段，以植物干細胞作為受體生產抗體、疫苗以及其他蛋白藥物也將會在生物藥物生產中被廣泛應用。在實際培養中關于植物干細胞分離和鑒別方面還存在很多不足，外植體誘導出細胞后，如何精確分離干細胞，保證干細胞的純度，以及建立規范的鑒定體系是目前干細胞培養面臨的主要問題。
文獻來源：生物工程學報, 2018, 34(11): 1734-1741
Chinese Journal of Biotechnology, 2018, 34(11): 1734-1741
10.13345/j.cjb.180047