哺乳動物細胞灌流培養工藝研究進展

1 背景介紹
在美國或歐洲的臨床開發階段有超過900種生物制藥產品,其中大部分是在哺乳動物細胞培養系統中生產的,且人源化重組蛋白的加工只能通過哺乳動物細胞培養來實現,因此哺乳動物細胞培養工藝的開發對生物制藥產業顯得尤其重要[1,2]。

目前,生物制造行業最主要的培養模式是批次培養和補料批次培養。大多數生物藥物分子是不穩定的,在批次和補料批次培養過程中,細胞產生的代謝產物、死亡細胞釋放的酶、以及滲透壓的增加對細胞生長都是不利的,對于蛋白質量也是不利的[3]。隨著人們對生物制藥工藝的深入研究,治療性蛋白的連續一體化生產在實驗室、臨床領域以及商業制造領域正在逐漸取代傳統的批次培養[4]。食品藥品監督管理局(food and drug administration,FDA)等監管機構鼓勵生產工藝的改進與創新,其中包括連續性制造,這種轉變受到新興技術以及仿制藥模型研究者的青睞[5]。

灌流培養通過不斷移出副產物,同時補充營養物質,因此可提供對細胞穩定且有利的生長環境。與批次培養和補料批次培養相比,灌流培養可以在高細胞密度環境下長時間維持穩定培養環境,同時降低產物在培養基里的停留時間,這有利于提高產品質量[6]。Ahn 等[7]研究發現,灌流培養可實現培養基組分中的動態變化對蛋白質糖基化的影響最小,這一研究結果表明灌流培養有利于提高產品質量。

對于細胞培養而言,灌流培養并不是一種新興技術。自20世紀90年代以來,許多商品化生物藥物采用灌流培養,例如阿昔單抗、β-葡糖腦苷脂酶、英夫利昔單抗、巴利昔單抗、干擾素β-1α、重組人凝血因子VIII、戈利木單抗等[8]。

傳統的灌流培養多借助微載體,微包囊法進行連續灌流[9,10,11]。國內現已有將傳統灌流培養工藝成功用于生產的案例,藥物普佑克(注射用重組人尿激酶原)采用無血清連續灌流培養技術實現大規模生產,用于急性ST段抬高心肌梗死治療,該藥物于2011年成功上市[12]。

當前多樣化的生產環境中,生物技術公司越來越傾向于開發高度靈活和高效能的生產制造工藝[13]。灌流培養作為實現提高穩定性低的重組蛋白產量的有效手段已廣泛用于生物工程產業[6]。灌流培養能夠憑借小型生物反應器生產達到補料批次培養大規模生產所得的蛋白量,實現了培養規模小型化,增加了操作的靈活度[14]。

2 灌流培養
2.1 細胞截留系統
分離裝置的穩固性對于有效分離和實現高細胞密度至關重要[6, 14-15]。目前,用于灌流培養的細胞截留系統主要有兩種,切向流過濾(tangential flow filtration,TFF)和交替切向流過濾(alternative tangential filtration,ATF)。對于TFF,細胞液通過蠕動泵作用形成一個連續的環形流動方向,進入纖維膜后,廢液會通過膜排出體系之外,細胞會隨著環路重新回到培養體系之內。ATF是通過隔膜泵的往復吹吸作用,實現罐內培養基在截留設備中的往復流動,同時代謝廢物會隨著培養基通過膜排出而細胞截留在反應器內。使用ATF時,交替運動在過濾膜中產生沖刷作用,有助于防止纖維膜堵塞[15]。并且,ATF在提高單位體積產率上也有優勢,Bosco等[16]研究表明當使用ATF代替內部旋轉過濾器(internal spin filter,ISF)時,單位體積產率可提高50%70%。

ATF是目前采用更多的一種方式,但是也有研究發現ATF在提高細胞密度上的優勢不如TFF,據Clincke等[17]報道,在密度為(2030)×106 cells/ml情況下使用ATF和TFF均可持續培養2周;在高密度(90100)×106 cells/ml下,使用ATF可維持4天,而使用TFF可持續培養兩周。因此對于ATF和TFF的選擇需要綜合考慮細胞的適用程度。

目前也存在一些新型細胞截留裝置用于灌流培養,Kwon等[18]介紹了一種基于慣性分離的微流體細胞截留系統,用于懸浮哺乳動物細胞的灌流培養,但是該裝置現只用于實驗室規模的培養。

2.2 N級灌流細胞培養
N級生物反應器(生產型生物反應器)中,由于營養或設備限制,細胞量可迅速達到系統容量的上限,細胞活力迅速下降[4]。N級生物反應器在使用灌流培養時,實現對細胞密度的有效控制可以防止上述情況,并且細胞量可穩定維持較長的生產期。通常使用半連續或連續性排細胞來控制細胞密度。Karst 等[19]人使用TFF和ATF通過連續性排細胞可將細胞密度控制在20×106 cells/ml,40×106 cells/ml,60×106 cells/ml三個穩定階段,每個階段可維持一周以上的時間。

2.3 整合連續性操作
隨著反應器灌流培養與下游純化的結合,連續性操作得以深入研究,其優勢也越來越明顯,它有利于捕獲和純化過程。由于樹脂的價格昂貴,增加捕獲步驟的樹脂利用率顯得越發重要。Steinebach等[20]介紹了一種連續處理細胞培養發酵液的雙柱捕獲系統,與批次培養的連續捕獲相比,該方法的樹脂親和捕獲性能利用率提高了2.5倍,該系統同時具有預測產量、生產率和產能利用率等工藝性能的功能。Angelo等[21]在最近的中試規模試驗中確認了該性能的提高。Steinebach等[22]最新研究表明,連續捕獲過程的灌流培養可實現純度更高的蛋白質穩定的生產。

2.4 灌流培養工藝的應用
2.4.1 細胞庫和種子培養減少種子培養時間是工藝優化的一個重要方面[23]。為了縮短接種N級生物反應器達到所需活細胞密度的時間,提高初始細胞量是一種有效方法。通?？刹扇煞N方式:增加接種物體積或濃度。增加接種體積可使用高密度冷凍管(如5 ml冷凍管)或冷凍袋(如50ml或100 ml冷凍袋)來實現。增加接種物濃度可使用灌流培養技術,該技術已被用于制備高密度細胞庫(HD Cell Bank),通過在N-1生物反應器階段聯合使用高密度細胞庫、一次性技術和灌流培養系統,建立了新型種子細胞培養技術[6, 24]。這種新技術通過減少中間放大的次數和清潔、組裝、滅菌等人為操作的需求來降低種子培養過程的復雜性。

2.4.2 濃縮補料批次培養濃縮補料批次(concentrated fed-batch,CFB)細胞培養通過使用灌流培養技術,結合使用超濾模塊截留細胞和蛋白產物。CFB可實現靈活的生產,在有限的體積下增大細胞密度,使得小型生物反應器的產量可以與大型生物反應器相媲美。Yang等[25]通過制定CFB培養并將其應用于兩種細胞系,在實驗室規模生物反應器上進行了相關試驗。與傳統的補料批次培養相比,CFB培養將細胞系A產量提高了105%,細胞系B產量提高了70%,并且對產品質量沒有明顯影響,細胞系B的電荷異質性還有所改善,這表明CFB具有工藝和產品質量的優勢。

2.4.3 混合培養工藝 Hiller等[26]在混合培養工藝研究中,培養前4天使用灌流培養以快速增加細胞量,之后停止灌流并每天連續補加濃縮補料。該研究使用5種CHO-k1細胞,最高產率比傳統補料批次培養增加2.5倍。培養過程中,細胞密度達到(6080)×106 cells/ml,灌流培養基消耗量相對較低(是最終生物反應器體積的1倍1.8倍)。該工藝通過使用新型灌流調控系統,能夠在線監控并自動控制灌流速率進而實現自動化。因此,該工藝可改善現有生產線的性能。

3 灌流培養工藝的開發
3.1 工藝控制
穩定的工藝需要適當控制培養基的補進和流出速度,保持所需的灌流速率。通過活細胞濃度的實時監測、穩定理想的細胞特異性灌流速率(cell specific perfusion rate,CSPR)以及灌流速率等參數來調節細胞排出量,反應器內可維持恒定的工作體積和細胞密度。沒有細胞密度在線控制系統的情況下,最常使用半連續排細胞方式控制細胞量。Karst等[19]通過線上和線下控制系統完成連續排細胞以維持細胞密度穩定,但是線下控制水平對生產工藝性能和產品質量存在一定的影響,這種半連續方式在商業規模的生產中需謹慎使用。

單位體積產率和產品質量是生物制藥細胞培養過程的兩個關鍵性能指標。Yang等[27]使用三種不同的CHO細胞系灌流培養,通過提高單位體積產率來優化產能利用率和生產效率,同時能保持或提高產品質量。Rodriguez等[28]研究表明在CHO細胞生產重組人干擾素-β(β-IFN)時,低溫灌流培養與批次培養相比,產率可提高3.5倍,單位體積產率提升7倍,并且可降低39%的聚集體和提高一定的生物活性。Hiller等[26]研究發現在生物反應器中進行短時間灌流,緊接著使用高濃縮補料進行常規補料分批培養,與傳統補料分批工藝相比,整體產率增加近一倍。Warikoo等[9]研究表明,灌流反應器和四柱式周期性逆流色譜(four-column periodic counter-current chromatography,PCC)的整合系統用于連續捕獲目的蛋白,比當前灌流或補料分批培養的單位體積產率高得多。

3.2 培養基篩選
在細胞培養開發和優化過程中,培養基的開發是最重要的一個方面。一方面是因為培養基對于工藝性能而言是首要的,另一方面是出于安全考慮。第一種細胞培養基使用動物衍生制品[29],使用相應產品的病人將暴露于許多危險因素,如病毒等。

解耦灌流培養基(即不同口流入以便能夠更好地控制特定營養素和灌流速率)的概念對于培養基開發有了新的啟發。Lin等[30]使用基于補料批次培養工藝的基礎培養基和濃縮補料按一定比例混合獲得一種濃縮培養基,在此基礎上進而開發出一種有效的灌流培養基。在獲得最佳比例并調節一些營養物質濃度和滲透壓后,獲得的培養基僅需要一半的灌流速度就可維持30×106 cells/ml的密度。這為灌流培養基的開發提供了參考作用。

3.3 培養規模小型化
微型生物反應器是小型培養的另一種選擇,它可提供pH和DO在線監控[31],到目前為止主要用于補料分批培養,但也進行了一些半連續培養基交換試驗。Gomez 等[32]通過使用半連續搖管操作和灌流反應器研究了13個克隆,并以此優化了補料批次培養過程。最近,一些商業化新型反應系統具備連續的培養基交換和細胞截留能力,這些設備已證明其在補料分批中的生產效率,并且可能在灌流過程開發中發揮重要作用,但仍需要更多數據來評估其全部潛力。

3.4 關鍵質量屬性
批量生產向連續性生產轉型的驅動因素有兩點,一方面是節省運營成本,更重要的是提升目的蛋白質量[4]。在非連續生產系統中,比如批次培養和補料批次培養中,累積的有毒物質和反應副產物對目的產物的質量有不利影響[3]。在灌流培養工藝中,在整個培養期間可維持穩定的培養環境,反應器中所有的動力學參數,包括與雜質或翻譯后修飾有關的動力學參數,不會隨時間變化,因此反應器內幾乎產生相同產物,沒有批次培養和補料批次培養的累積效應[4]。

Gomez等[32]研究表明,質量屬性中如半乳糖基化,非巖藻糖基化和聚體在搖管和小型生物反應器模型中是相當的,其他質量屬性更多地取決于產品停留時間,例如脫酰胺,C-末端賴氨酸化和剪切等在半連續模式中被發現是不同的。因此,灌流培養可通過減少產物在培養基內的停留時間提高質量屬性。

4 展望
4.1 灌流培養工藝的優勢
灌流培養通過不斷移出副產物和添加營養物來提供有利于細胞的穩定環境。與批次培養和補料批次培養相比,在高密度細胞環境下,灌流培養模式可以延長良好培養環境的時間,降低產物在反應器內的停留時間,這對于產品質量是有利的,對于性質不穩定的產品也是必要的[33]。

此外,目前生物技術公司需要快速調整生產能力以適應波動的市場需求,來自生物仿制藥公司越來越激烈的競爭進一步推動降低成本[9, 33]。與補料批次培養相比,灌流培養的另外一種優勢是可以使用更小型的生物反應器,這意味著灌流培養可以減少清潔操作,其較小的反應體積可使用一次性生物反應器代替不銹鋼反應器。灌流培養除了可以用于生產生物制品以外,還可以用于生產高密度種子庫,細胞庫或者是作為蛋白藥物生產的研究工具。灌流培養可以以高細胞密度生產目的蛋白產物來補償低細胞產率的不足,這將節省工藝開發的人力需求。

從法規層面來看,FDA等對連續連生產持開放和支持的態度,他們認為連續灌流是一項能帶來穩定和更高效生產的技術[5, 33-34]。由于灌流培養具備多樣化產品線,國內一些大型生物制藥企業也開始嘗試從傳統的補料批次培養向灌流培養轉變,以期待解決傳統培養工藝存在的問題。

4.2 灌流培養工藝的不足
灌流培養也存在缺點,在技術開發及無菌工藝上存在諸多挑戰,并且培養產生多個收集批次的產品匯集成許多中等體積的收集物不斷累積,需要進一步處理[15]。

長期高密度細胞的灌流培養,多數細胞截留裝置堵膜的風險明顯提高。新型細胞截留裝置的產生可以較好的解決這一問題。ATF的交替運動在過濾膜中產生沖刷作用,有助于防止纖維膜堵塞[16]。Xu等[35]通過添加聚醚(泊洛沙姆)來優化灌流培養基,添加低濃度聚醚有利于產物以及宿主蛋白透過細胞截留裝置,同時對細胞具有保護作用,這一點有利于降低堵膜的風險。

國內外灌流培養工藝開發所用的灌流培養基多為自主開發,目前商品化的灌流培養基十分有限,這對灌流培養工藝的開發有一定的阻礙。灌流培養基的營養成分通常比普通的基礎培養基營養豐富,研究顯示,基礎培養基與濃縮補料按一定比例混合制成的灌流培養基可以維持較高的細胞密度與活率[25]。Yang等[27]研究表明,使用兩倍濃縮的培養基用于N-1灌流生物反應器時,可降低灌流速率,同時細胞生長速率可以更高?；诖搜芯?灌流培養基的開發有了一定的研究方向。在成本控制方面,Xu等[35]同時研究了同一細胞在不同工藝下的產率,發現生物反應器利用率高時,灌流培養的培養基成本有望低于補料分批培養的培養基成本。

生物技術領域嚴格的質量要求及監管要求下,生物制藥行業追求最短的開發時間和控制最少的成本,這些因素必然導致其對新技術的實施持保守態度。通常情況下,企業只會采取漸進式優化措施,而更為重要的技術革新不再那么普遍。生物技術創新變得更加以產品為中心的創新而不是以培養工藝為中心的創新。上述商業驅動仍然占據主導地位,但是現如今,生物技術公司需要靈活的適應大量和小量需求的藥物(小生境或孤兒藥),最好能在同一生產線內完成。未來的生物制造工廠正在從大型單一生產線向更小、更多元化、更靈活的生產線轉變,靈活的生產線使公司能夠適應不斷變化的市場需求[25]。Yang等[25]研究表明,灌流培養有望在產能上實現小型生產設備取代大型生產設備的目標。

5 結語
灌流培養作為一種新型技術極大的拓展了人們對生產工藝的理解,它解決了因蛋白質量不穩定或者表達量偏低,以及補料批次培養無法保證批次穩定控制等一系列問題,而且可去除中間一些不必要的放大步驟,簡化了生產工藝。但與此同時,其特定的培養模式也面臨著一些挑戰,比如如何在長時間的培養中防止染菌,驗證從收獲到純化得到的各“亞批次”之間的一致性等,這些問題在企業臨床研究申請(IND)時會顯得尤為重要。

上述討論的工藝開發關鍵點看似相互分離,但實則牽一發而動全身,實際過程中切不可只考慮到某一因素對結果的影響,而應采用多變量分析的方法充分考慮不同變量之間的關系,以及綜合效應對產物表達和質量的影響。因此,實現高質量蛋白穩定均一表達與生產的連續灌流培養工藝還需要投入更多的時間和精力。

上一篇：沒有了

下一篇：生物丁醇發酵研究進展